骨质疏松症是以骨组织显微结构受损，骨矿成分和骨基质等比例不断减少，骨质变薄，骨小梁数量减少，骨脆性增加和骨折危险度升高的一种全身骨代谢障碍的疾病。其主要临床表现为骨痛及腰背痛、驼背、易发骨折等，其中以原发性骨质疏松症最常见。因骨质疏松症引发的骨折及其并发症是老年人致残和致死的重要原因。随着进入老龄化社会，骨质疏松症病人逐年增加。以髋部骨折为例，每年全球约有450万患者，其中50%的病人属于亚洲国家，因此骨质疏松症将是一个严峻的公共卫生问题，对骨质疏松的防治研究具有重要的医学和社会学意义。
酪蛋白激酶2相互作用蛋白(CKIP-1) 是近年被发现的一种新型凋亡因子，研究表明其在骨质疏松成骨过程中起到重要作用，是骨形成负调控因子。本文综述了CKIP-1与骨质疏松症的关系。
1.CKIP-1结构和特性
CKIP-1是在研究酪蛋白激酶2( CK2)的过程中发现的。CK2存在于所有的真核细胞中，CK2在不同物种中具有高度保守性，具有重要的生物学功能，参与包括转录、翻译、形态发生及细胞周期调控在内的许多生物学过程。CK2是一个四聚体ser /thr蛋白激酶，具有两个调控亚基( β2)，两个催化亚基( α和α1)。研究发现，CK2的两个催化亚基具有功能的特异性，如CK2α1与控制细胞的增殖和存活有关。因此，在用酵母双杂交技术鉴定与CK2相互作用的蛋白质时，发现了一种新型的CK2相互作用蛋白: CKIP-1能与CK2α相互作用，但不能与CK2α1相互作用。后来人们又通过实验发现CKIP-1在体外条件下不能改变CK2激酶的活性，CK2也不能改变CKIP-1蛋白的磷酸化水平，所以推测CKIP-1既不是CK2的直接调控因子，也不是CK2的底物，而认为是CKIP-1的一种非酶活性的间接调控因子，它通过调节CK2的亚细胞定位发挥对CK2功能的调控作用。全长的CKIP-1 cDNA编码有409个氨基酸，分子量约为46kD。其蛋白质分子的N端包含一个PH结构域，它与CKIP-1的质膜定位密切相关，还参与CKIP-1与其他蛋白质的相互作用(如与CK2的相互作用)。可以和Akt发生相互作用，抑制肿瘤的增殖。CKIP-1的C末端结构域可以通过caspase-3切割的方式被释放，结合并调控C-Jun /AP-1的转录因子活性，促进肿瘤细胞凋亡。CKIP-1可以招募ATM到质膜定位，为毛细血管扩张性共济失调综合征(ATS)病人来源细胞的质膜异常表达提供分子机制; CKIP-1可被IFNγ和IL-2诱导表达，通过与IFP35和Nmi的相互作用，防止细胞因子应答过度; CKIP-1的PH 结构域具有核定位信号的功能，提示CKIP-1的N端PH结构域的核定位信号与C端PH抑制信号之间的协调作用在调控CKIP-1亚细胞定位中的决定作用。
CKIP-1是一种没有酶活性的调控蛋白，但是它具有许多参与蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-脂质相关互作用的结构域或模体，具有非常重要的生物学功能。CKIP-1通过与其他蛋白质或脂质的相互作用，可能在介导细胞质与细胞核之间的信号转导中起到重要作用，它通过自身亚细胞的定位调节其他分子的亚细胞定位从而对其功能进行调控，在癌变、凋亡在内的许多细胞行为中发挥着重要的作用。研究表明CKIP-1通过Smurf1介导的泛素-蛋白酶体调控成骨过程，发挥重要的负调控作用。
2.CKIP-1成骨抑制作用
泛素-蛋白酶系统是真核细胞中蛋白质降解的主要途径。发现这一途径的3位科学家在2004年被授予诺贝尔化学奖。泛素(Ub)是由76个氨基酸组成的极为保守的蛋白。泛素化修饰是一种常见的蛋白质修饰，广泛参与蛋白质的降解，细胞的吞噬作用，跨膜蛋白的分类与转运，DNA的修复等细胞生物学过程。在泛素化过程中有3种酶介导了这一过程，它们是泛素活化酶( E1)、泛素结合酶( E2)和泛素连接酶( E3)。E3可以促进单泛素或多泛素转运到底物上。Smurf1 属于E3泛素连接酶家族。泛素标记需要被降解的蛋白质，继而使被标记的蛋白在蛋白酶体中被降解。E3泛素连接酶主要负责特异性识别靶蛋白底物。Smurf1主要通过与Smad1、5作用，引发Smad蛋白及与它们相互作用的蛋白质的泛素化和降解。Smurf1含有1个HECT结构域和2个WW结构域。在HECT结构域的羧基端有一个高度保守的半胱氨酸残基，该半胱氨酸与泛素之间可形成硫酯键，一旦将这个高度保守的半胱氨酸残基突变为丙氨酸或甘氨酸后，Smurf1便完全丧失其泛素化和降解特定蛋白质的活性。WW结构域是Smurf1的另一个重要特征，定位于其第236到311位氨基酸之间，含有大约30个氨基酸，其中包含高度保守的2个色氨酸和1个脯氨酸，具有与富含脯氨酸的小肽( PPXY结构)相结合的能力。
Smurf1介导BMP受体的降解，骨形态发生蛋白(BMP)是一类具有多种功能的分泌型细胞生长因子，属于TGF-β超家族的成员。经典的BMP信号通路由BMP配体、BMP特异性受体、Smads信号转导蛋白等组成，Smurf1通过介导BMP I型受体的降解，影响BMP /BMPR I s /BMPR-ⅡS三聚体的形成，进而从起始抑制BMP信号通路的下传。Smurf1同Smad6 /7在细胞核内结合，然后共同出核被运送到细胞膜上引发BMP I型受体的降解。Murakami等发现，仅有Smad6 /7或者Smurf1降解BMP I 型受体的能力大为下降，提示这种降解功能是由两者形成的复合物共同完成的。
Smurf1介导Smad1和Smad5蛋白的降解: 早期在非洲蟾蜍胚胎中证实Smurf1可以介导Smad1的降解。Zhao等通过检测成骨细胞中Smurf1对Smad1降解的介导作用，发现在成肌/成骨前体细胞C2C12细胞系中，Smurf1可以剂量依赖性地介导Smad1的降解，并且Smurf1介导Smad1的降解是以一种蛋白酶体依赖性的方式进行的。研究发现，一旦Smurf1的催化位点发生突变，其对Smad1的降解作用将明显变弱。同时蛋白酶体抑制剂可以剂量依赖性地逆转Smurf1对Srnad1的降解作用。许多不同的蛋白酶体抑制剂也可以增强内源性Smad1蛋白的水平。Ying等通过在C2C12细胞系中过表达Smurf1发现Smad5蛋白的水平明显降低，并且这种降低可以被乳胞素(一种蛋白酶体抑制剂) 逆转，通过ＲNA干扰技术沉默C2C12细胞内源性的Smurf1后，Smad5蛋白的水平明显上升。Smurf1 介导转录因子Ｒunx2 蛋白的降解:Runxs是新发现的一类调控间充质干细胞向成骨方向分化的特异性转录因子，包括Runx1、2、3。Runx2通常也称作Cbfal(核结合因子)，其作为BMP-2的靶基因，是成骨细胞分化、骨发育的重要调节因子，在成骨细胞分化过程中起着重要作用。Runx2在BMP信号通路中同Smad1蛋白结合形成一种复合物，共同激活下游靶基因的表达。由于转录因子Runx2蛋白结构中含有Smurf1可识别的PY 结构，Zhao等研究了Smurf1在C2C12和成骨前体细胞系2T3中对RuNX2蛋白降解的介导作用，通过免疫共沉淀实验证实了Smurf1蛋白和Runx2蛋白之间的相互作用。Smurf1可以剂量依赖性地降低细胞中原本十分稳定表达的Runx2蛋白水平，并且这种降解现象是蛋白酶体依赖性的Smad6在与Runx2结合的过程中，可以增强这一降解作用。
CKIP-1可以作为Smurf1的激活因子，在Smurf1介导的泛素-蛋白酶体降解途径中发挥功能。Smurf1作为泛素连接酶可以降解多种蛋白，包括Smad1/5、TGF-β受体、BMP受体、骨特异性转录因子Runx2以及磷酸化形式的MEKK2等，从而负调控骨形成。CKIP-1的C末端结构域可以与Smurf1两个WW结构域之间的连接区发生相互作用，增强Smurf1 的泛素连接酶活性。CKIP-1基因敲除的小鼠表现出与Smurf1基因敲除小鼠相似的表型，即骨量的上升和骨形成速率的增强。同时，CKIP-1还可以结合蛋白酶体亚基Ｒpt6，作为接头蛋白偶联Smurf1与蛋白酶体，增强泛素化蛋白底物的降解，CKIP-1在Smurf1与底物的相互作用以及底物招募至26S蛋白酶体的过程中发挥双重作用。综上，CKIP-1作为Smurf1的增强性因子，可以通过调控Smurf1的泛素连接酶活性来影响骨量，CKIP-1作为生理条件下的骨形成负调控因子，有望成为新的治疗骨质疏松的药物靶点。见图1。
图1 CKIP-1 与相互作用蛋白的结合区域
3.CKIP-1 在骨质疏松治疗中的地位
骨骼形成之后，终生都处于由成骨细胞控制的骨形成和破骨细胞控制的骨吸收共同调控的重塑过程之下。这种重塑过程中的平衡一旦被打破，就会导致骨骼系统出现异常，进而引起骨病的发生。成骨细胞和破骨细胞共同维持着成骨的稳态，二者的功能相反，而且二者的来源也截然不同，成骨细胞是由间充质干细胞分化而来，而破骨细胞则是由骨髓中的单核/巨噬细胞前体细胞分化而来。过去10多年的研究大大丰富了人们对破骨细胞分化及功能调控的分子机制的了解，其中突破性的研究进展是RANKL/RANK/OPG信号通路的发现和破骨细胞体外诱导培养技术的建立，目前破骨细胞已成为重要的药靶，但是以破骨作为药靶的骨质疏松治疗药物有一个明显缺陷，即其只能降低骨吸收的速率，并不能刺激重症骨质疏松患者的新骨形成。Lu等证实破骨相关的标志物分子在血清中检测没有发现差别，用长骨组织的ＲNA检测也没有发现破骨细胞相关的标志物基因转录水平的变化，并且Smurf1在破骨细胞中不表达，提示CKIP-1可能不影响破骨细胞的功能。
相对而言，对控制成骨细胞分化的基因了解较少，基于成骨细胞功能研究的药物研发报道非常有限。目前研究证实以成骨细胞分化特异转录因子Runx2为代表的一系列转录因子和信号转导分子在发育早期成骨细胞介导的骨形成中发挥重要作用。这些敲除小鼠往往表现为出生时骨骼发育缺陷(如Runx2)。这些对胚胎期骨发育具有重要作用的基因往往因为副作用大而难以成为药物靶标。对于骨病来说，其主要发病人群表现为骨质疏松。中老年发病居多，在绝经期后的妇女中表现尤为严重。现在仅仅发现了几个分子影响了成体内成骨细胞的功能(Stat1、LRP5、Tob、Shn3、Smurf1)，而对这些基因和信号通路的深入研究有可能找到促进成骨细胞活性使骨形成增加，从而有效治疗骨质疏松这种老年病的方法。最新研究表明CKIP-1影响了体内成骨细胞的功能。CKIP-1敲除小鼠的骨量升高随着年龄的增大而更加显著，这种小鼠对于体内成骨细胞调控机制的研究可以起到很好的推动作用。同时提示CKIP-1 有可能成为理想的药物靶标。
4.CKIP-1尚待解决的疑问
CKIP-1是影响了全身的骨量还是部分骨量?骨的形成分为两类，膜内成骨和骨内成骨，而对于长骨来说又分为皮质骨和松质骨，那么CKIP-1对骨骼系统的影响是广谱性的还是特异性的? 部分研究显示与野生型小鼠相比，CKIP-1敲除的小鼠表现的骨量升高在顶骨、尾椎骨和股骨处尤为显著。
CKIP-1是否参与间充质干细胞的分化? CKIP-1的缺失可以增强成骨细胞的分化能力，而成骨细胞是由来源于中胚层的间充质干细胞分化而来，小鼠的间充质干细胞具有四系分化能力，可以分化为成骨细胞、成肌细胞、软骨细胞和脂肪细胞。那么CKIP-1敲除的小鼠其间充质干细胞分化能力是不是也得到了增强? 如果是，那么其影响了间充质干细胞的某一谱系分化还是四系分化能力? 对骨骼系统的分析发现，CKIP-1敲除小鼠与野生型相比，骨形态学上没有明显差异，提示可能没有影响软骨细胞的分化; 对脂肪组织的HE染色结果发现脂肪细胞形态上没有明显差别，但是否影响了两者的功能及影响了成肌细胞的分化，目前还没有相关报道。
CKIP-1在骨骼系统所发挥的作用对Smurf1的依赖程度有多大? 目前的研究仍然不能排除CKIP-1可以通过不调控Smurf1的通路影响成骨细胞，目前的数据只是证明在CKIP-1缺失的条件下Smurf1的活性确实受到了削弱，但是CKIP-1敲除小鼠骨量升高的表型是单独由于Smurf1活性降低导致还是包括Smurf1 在内的多个分子协同调节?
5.结语
CKIP-1是一种没有酶活性的调控蛋白，但是它具有许多参与蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-脂质相互作用的结构域或摸体，还有许多潜在的磷酸化位点，因此它具有非常重要的生物学功能。CKIP-1通过与其他蛋白质或脂质的相互作用，可能在介导细胞质与细胞核之间的信号转导中起到重要作用，它通过自身亚细胞的定位调节其他分子的亚细胞定位从而对其功能进行调控，在骨骼正常生理活动中起着至关重要的作用，并与多种骨疾病密切相关。因此，CKIP-1不仅是研究骨代谢、骨质疏松的关键，而且已成为骨质疏松治疗的靶点。
(来源：胡炯,中国骨质疏松杂志)
